LSR II

Centrum pro cytometrii a mikroskopii MBÚ AV ČR je vybaveno 16-ti barevným průtokovým cytometrem BD LSRII včetně FACS Flow Supply Systému a High Throughput Sampleru.

Přístroj byl modifikován Dr. Horváthem (Flow Cytometry and Microscopy facility of IMG) pro 4 excitační zdroje:

Hardwarová konfigurace

1. Optická část

405nm, 100mW - OBIS solid state (70mW regulovaně) 488nm, 20mW - Coherent Sapphire 488-20 DPSS laser 561nm, 25mW - Melles Griot 85-YCA-025 633nm, 17mW - JDS Uniphase 1144P He-Ne laser

 

Fialový laser, 405nm, 6 fotodetektorů

 

Modrý laser, 488nm, 4 fotodetektory

 

Žlutý laser, 561nm, 6 fotodetektorů

 

Červený laser, 633nm, 3 fotodetektory

K dispozici je sada optických filtrů a zrcadel umožňujících co nejširší využití přístroje podle požadavků uživatele.

Emisní filtry Dichroická zrcadla 425/20 440 LP 450/50 475 LP 488/10 505 LP 525/50 545 LP 530/30 550 LP 560/10 565 LP 560/20 575 LP 575/15 590 LP 575/26 595LP 585/15 600 LP 585/42 630 LP 605/12 635 LP 610/20 650 LP 655/8 658 LP 660/16 675 LP 660/20 680 LP 670/14 685 LP 675/20 710 LP 675/45 735 LP 685/35 755 LP 695/20 695/40 705/20 712/21 725/20 750/60 780/60 705/20

2. High Throughput Sampler (HTS)

HTS je zařízení, které umožňuje automatické měření vzorků průtokovým cytometrem přímo z 96 nebo 384 jamkových desek.

Zařízení se skládá ze dvou základních částí:

1. pohyblivého ramene s jehlou, které obstarává míchání a manipulaci se vzorky, míchání buněk v jamkách, nasátí a injektáž vzorku do cytometru.

2. pohyblivý stolek pro destičky.

Podrobný manuál k HTS (PDF)

3. Ovládací software:

BD FACS DiVa 6 

Obsluha přístroje:

1. Zapnutí

1. KROK: Před zapnutím přístroje zkontrolujte hladiny kapalin v nádobách FACS Flow Supply Systemu (FFSS).

Sheath kanystr nesmí být nikdy prázdný, dochází k zavzdušnění přístroje, které pak přináší dlouhodobou nestabilitu systému a znehodnocuje naměřená data.

2. KROK: Přístroj se uvádí do provozu stisknutím zeleného tlačítka na pravé straně čelního panelu přístroje.

3. KROK: Po zapnutí LSRII spusťte ovládací program FACS DiVa, po přihášení do programu se otevře výchozí sestava oken.

Počkejte až dojde k připojení cytometru k počítači. O stavu připojení jste informováni ikonou v pravém dolním rohu.

Než začnete měřit, nechte přístroj cca 10min stabilizovat.

2. Provoz

Vlastní obsluha LSRII je řízena tlačítky na čelním panelu přístroje.

Fluidními ovladači Lo, Med a Hi regulujeme rychlost nasávání vzorku, ovladač Sample Fine Adj slouží k jemnému doladění průtoku..

Tyto ovladače jsou funkční pouze při práci se zkumavkami, při práci s HTS je rychlost nasávání vzorku nastavována softwarově.

Orientační průtoky:

	Rozsah (ul/min)	Střed (ul/min)
Low	6 - 24	12
Medium	18 - 70	35
High	30 - 120	60

Tlačítkem Run spustíte nasávání vzorku přístrojem. V tomto módu neustále protéká přístrojem kapalina. Přístroj se do stavu Run přepíná pouze během měření.

Standby je pohotovostní režim. Do tohoto režimu uveďte přístroj vždy po u končení měření.

Prime slouží k pročištění měřící komory.

FACS Flow Supply System (FFSS)

FFSS je systém zajišťující průtok a stálý tlak nosné kapaliny v průtokovém cytometru. Systém se skládá z kontrolního panelu a dvou nádob.

Spouští se zapnutím průtokového cytometru. Vypínač na pravé straně ovládacího panelu zůstává stale zapnutý, svítí zelená kontrolka "System on".

Levá nádoba (PE kanystr) je určena na sheath fluid = nosnou kapalinu. PBS naředíte z 10 x koncentrovaného zásobního roztoku (1 litr 10 x PBS + 9 litrů deionizované H₂O)

Pravá nádoba je odpadní, při vyprázdnění přidáme cca 100ml SAVA.

Pokud během měření dojde Sheath fluid, případně dojde k naplnění odpadní nádoby spustí FFSS zvukovou signalizaci. Na čelním panelu se rozsviti červená kontrolka, která nás informuje o příčině alarmu.

Pískot musíte vypnout stiskem talčítka alarm, přepněte FACS na Standby, doplňte/vylijte tekutiny

!!!!!!!!!!!!!!! STISKNĚTE RESTART !!!!!!!!!!!!!!!

- zhasne červená kontrolka, přepněte FACS na Run a pokračujte v měření.

High Throughput Sampler (HTS)

HTS umístíte na stojan a lehce zasunete do cytometru. Při instalaci je třeba sledovat aby nedošlo k poškození nasávací jehly, nebo k uskřípnutí hadiček.

Připojte fluidní system:

1. Bílá hadička s bílými konektory SHEATH (B), oranžová hadička s oranžovými konektory WASTE (A).

1. Nasaďte Sample Tubing na jehlu, OPATRŇE A ZLEHKA dotáhněte.

1. Propojte elektroniku přístrojů pomocí RS232 konektoru a napájení zařízení.

1. Zapněte zařízení vypínačem umístěným na pravé straně přístroje, rozsvítí se zelená dioda.

1. Na LSRII přepněte nasávání vzorku ze zkumavky na nasávání z destičky.

Komunikaci mezi DIVA softwarem a HTS obstarává HTS menu v DIVA softwaru.

Před vlastním měřením je vhodné HTS proprat. Přepněte LSR II ze StandBy modu do stavu Run a v HTS menu DIVA softwaru klikneme na ikonu Prime.

O ukončení cyklu přístroj informuje akusticky a softwarově.

1. Pokud jste provedli všechny předchozí kroky a zkontrolovali nastavení přístroje, můžete zahájit měření.

3. Vypnutí přístroje

Vyexportujte si naměřená data.  DATA STARŠÍ 6 MĚSÍCŮ JSOU MAZÁNA.

Pokud jste používali jinou než standardní konfiguraci filtrů a zrcadel, vráťte přístroj do standardní konfigurace.

Po ukončení měření je třeba proprat HTS jednotku

Připravte 96 jamkovou U desku:

1. do pozice A1-A4 přidejte po 200ul 10% SAVO
2. do pozice B1-B4 přidejte 200 ul deionizované vody

Instalujte desku na HTS a z HTS menu DIVA softwaru spusťte "HTS daily clean" čistící program.

Celá procedura trvá cca 10min. O jejím ukončení budete informováni softwarově a akusticky.

Po práci ve zkumavkách přepněte LSR do HIGH modu a nasaďte zkumavku s 10% SAVEM, kterou po 2 minutách vyměnte za zkumavku s deionizovanou vodou kterou necháte přístroj propírat také 2 minuty. Po té nasaďte zkumavku s 2ml deionizované vody a přepněte LSRII do Standby modu.